L'audioguida è un sistema audio dotato di auricolari che spiega, nella lingua selezionata, la storia e le peculiarità dell'affresco di Leonardo. Ha una durata indicativa di 20 minuti. Le audioguide del Cenacolo sono disponibili in: italiano, inglese, francese, tedesco, spagnolo, russo, mandarino e giapponese. Le audioguide sono acquistabili unicamente insieme al biglietto d'ingresso.